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    凝膠過濾層析的原理及使用方法
    來源于:上海聯碩生物科技有限公司,浙江聯碩生物科技有限公司 | 發布時間:2021/9/13 14:52:00

    原理:
    凝膠過濾層析是利用具有多孔網狀結構的顆粒的分子篩作用,根據被分離樣品中各組分相對分子質量大小的差異進行洗脫分離的一項技術。
    凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)法又稱為排阻層析或分子篩方法,主要是根據蛋白質的大小和形狀,即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質,多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質,使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。也叫做分子排阻層析(molecular-exclusion chromatography)。一種利用帶孔凝膠珠作基質,按照分子大小分離蛋白質或其它分子混合物的層析技術。 一般是大分子先流出來,小分子后流出來。

    使用方法:
    ⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開,由于它們在分配系數上有顯著差異,這種分離又稱組別分離,一般可選用SephadexG-25和G-50,對于小肽和低分子量的物質(1000-5000)的脫鹽可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離,這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠,層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部,由于Kd不同,最后得到分離。

    ⒉柱的直徑與長度根據經驗,組別分離時,大多采用2-30cm長的層析柱,分級分離時,一般需要100cm左右長的層析柱,其直徑在1-5cm范圍內,小于1cm產生管壁效應,大于5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間,但對移動慢的物質宜在30-40之間。

    ⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后,將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹,溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長,加熱可使溶脹加速,即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸,1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
    凝膠的裝填:將層析柱與地面垂直固定在架子上,下端流出口用夾子夾緊,柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器,柱內充滿洗脫液,將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛于柱頂的容器中,然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內,這樣凝膠粒水平上升,直到所需高度為止,拆除柱頂裝置,用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間,再開始流動平衡,流速應低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速,千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜,使用前要檢查層析床是否均勻,有無“紋路”或氣泡,或加一些有色物質來觀察色帶的移動,如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好,色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。

    ⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡后,在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和,再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數無關,故樣品濃度可以提高,但分子量較大的物質,溶液的粘度將隨濃度增加而增大,使分子運動受限,故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入后打開流出口,使樣品滲入凝膠床內,當樣品液面恰與凝膠床表面相平時,再加入數毫升洗脫液中洗管壁,使其全部進入凝膠床后,將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連,預先設計好流速,然后分部收集洗脫液,并對每一餾份做定性、定量測定。

    ⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復使用,不必特殊處理,并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌,可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉,在下次層析前應將抑菌劑除去,以免干擾洗脫液的測定。

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